引言

高酪氨酸血症III型（HTIII）是一种罕见的常染色体隐性遗传代谢疾病，由4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（HPD）基因突变引起，导致酪氨酸代谢通路异常及毒性代谢产物积累。由于缺乏理想的动物模型，该疾病的病理机制研究和治疗策略开发面临挑战。近年来，基因编辑技术的突破为构建疾病特异性动物模型提供了可能。巴马小型猪因其生理结构、代谢特征与人类高度相似，成为构建代谢疾病模型的理想物种。本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除巴马小型猪Hpd基因，成功建立HTIII疾病模型，为深入研究该病提供了关键平台。

Hpd基因敲除模型的构建与验证

通过以下步骤完成Hpd基因敲除巴马小型猪的制备：

• 设计靶向Hpd基因外显子的sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统进行胚胎显微注射
• 移植编辑后的胚胎至代孕母猪体内获得F0代基因编辑猪
• 采用PCR和测序技术验证基因敲除效率及脱靶效应
• 通过Western blot检测肝脏组织中HPD蛋白表达缺失

检测范围与项目

为全面评估模型表型，检测涵盖以下层面：

• 基因层面：基因型鉴定、mRNA表达量分析
• 代谢层面：血清酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸浓度检测
• 器官功能：肝功能指标（ALT/AST）、肾脏代谢物分析
• 病理特征：肝脏/肾脏组织切片染色（HE、Masson）
• 影像学表现：腹部超声观察器官形态变化

检测方法与仪器

分子生物学检测

• 实时定量PCR：使用ABI 7500系统检测Hpd mRNA水平
• Sanger测序：Applied Biosystems 3730xl分析基因编辑位点

代谢产物分析

• 液相色谱-质谱联用（LC-MS）：Thermo Q Exactive系统定量酪氨酸代谢物
• 全自动生化分析仪：贝克曼AU5800检测血清生化指标

病理学检测

• 组织病理成像系统：Leica DM6000B显微镜采集切片图像
• 免疫组化分析：Dako Autostainer Link 48完成染色

影像学检测

• 超声诊断系统：GE Voluson E10进行腹部器官扫描

模型特征分析

Hpd^-/-巴马猪呈现典型HTIII表型：

• 出生后3周血清酪氨酸浓度升高至350±45 μmol/L（野生型＜60 μmol/L）
• 尿液中4-羟基苯丙酮酸排泄量增加5-8倍
• 6月龄出现肝细胞空泡变性和肾小管结晶沉积
• 肝脏HPD酶活性降低至正常值的8.3%±2.1%

模型应用价值

该模型具有显著优势：

• 准确模拟人类HTIII的渐进性病理进程
• 适用于新型治疗策略（如基因疗法、酶替代疗法）的长期疗效评估
• 为研究酪氨酸代谢紊乱与其他器官损伤的关联机制提供平台

结论

本研究成功构建Hpd基因敲除型HTIII巴马小型猪模型，通过多维度检测验证其表型可靠性。模型在代谢指标异常、器官病理改变等方面与人类疾病高度吻合，为HTIII的机制研究和新药开发提供了不可替代的动物平台。未来研究将聚焦于：1）完善产前诊断方法体系；2）建立标准化表型评价标准；3）探索靶向Hpd基因的精准治疗策略。

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